コンスタンティノスCミロナス、 プロジェクトコーディネーター（HCMR、 グリー）、 Birgitta Norberg、 生殖と遺伝学-アトランティックオヒョウリーダー（IMR、 ノルウェー）、 クリスティンハムレ、 栄養-アトランティックオヒョウリーダー（NIFES / IMR、 ノルウェー）、 Torstein Harboe、 幼虫の飼育-大西洋オヒョウリーダー（IMR、 ノルウェー）、 ソナル・パテル、 魚の健康-大西洋オヒョウリーダー（IMR、 ノルウェー;現在VAXXINOVAにいます。 ノルウェー）とロシオロブレス、 普及リーダー（CTAQUA、 スペイン）
EUが資金提供するDIVERSIFYプロジェクトに含まれる種の1つ、 2013年から2018年の間に走ったのは、タイセイヨウオヒョウ（Hippoglossus hippoglossus）でした。タイセイヨウオヒョウは世界最大のヒラメで、300kg以上の体重に達することができます。それは世界中の市場で高く評価されています、 しかし、野生のタイセイヨウオヒョウの入手可能性は減少しています。
ノルウェーの株は実行可能として分類されます、 しかし、漁業は厳しい規制の対象となります。これにより、タイセイヨウオヒョウに対する市場の需要が高まりました。 これは漁業だけでは満たすことができません。
タイセイヨウオヒョウ（図1を参照）は半脂肪の魚で、 オメガ3脂肪酸が豊富で、 骨の少ない特徴的なフレーク状の白身の肉です。養殖大西洋オヒョウは評判が高く、伝統的に大きな魚のステーキやカツレツとして販売されています。典型的なスカンジナビアスタイルで燻製またはマリネすることができます。これらの特徴により、DIVERSIFYにタイセイヨウオヒョウが含まれるようになりました。 ヨーロッパの水産養殖における魚種と製品の多様化の素晴らしい候補として。
タイセイヨウオヒョウの研究と栽培の取り組みは1980年代に始まりました。 養殖タイセイヨウオヒョウの年間総生産量は増加していますが、 2017年にはまだ1600トンにしか達していません（ノルウェー水産局）。
ヨーロッパで、 大西洋オヒョウ農場はノルウェーとスコットランドに存在します。望ましい市場規模は5〜10 kgで、生産期間は現在4〜5年です。 1985年から2000年の間に多大な研究努力があったにもかかわらず、 タイセイヨウオヒョウの複雑なライフサイクルにより、養殖の進歩が遅くなりました。 その後、研究資金はほとんど割り当てられていません。
しかし、 この間、生産の安定性を向上させるために、農民はゆっくりではあるが着実な進歩を遂げてきた。 ケージ文化と陸上文化の両方への関心が高まっています。生産量の増加と安定のための残りのボトルネックは、稚魚の安定供給と生産時間の短縮の必要性に関連しています。
後者は、「すべての女性」の若年生産の最近の確立によって達成される可能性があります。これは、雌がより速く成長し、後で成熟するため、生産時間に大きな影響を与えると予想されます。5kg未満の屠殺された魚の80％は成熟した雄です。
プロジェクトDIVERSIFYは、生殖における協調的な研究努力により、これらの重要なボトルネックに対処しました。 幼虫の栄養と畜産およびワクチンの開発。生物学的、 DIVERSIFYで開発された技術的および社会経済的研究活動は、EU養殖産業の多様化を支援し、生産の拡大に役立つことが期待されています。 養殖製品の増加と新しい市場の開拓。
再生
私たちのプロジェクトでの研究により、野生で捕獲された雌は確実に産卵し、一貫して非常に高品質（> 85％の受精）の卵を産むことが確認されました。飼育された雌はまた、排卵周期が確認されたときに高品質の卵子を産みました。 ストリッピングは排卵の近くで行われました（図2を参照）。
商業生産の場合、 繁殖目的だけでなく、 野生の雌に頼るのは現実的ではありません。しかし、 比較的少数の養殖雌が一貫して受精率> 80-85パーセントで卵を産みました。結果として、 十分に広い遺伝物質を確保するために、将来の繁殖グループにも野生で捕獲された種親を含める必要があるかもしれません。
養殖ブリーダーの性ステロイドの血漿中濃度は、タイセイヨウオヒョウで以前に報告されたものと同様でした。 卵巣の成長と成熟に続く年次プロファイルを持ちます。最高の17β-エストラジオール（E2）レベルは、産卵直前に記録されました。 2月の初めに、 E2とテストステロン（T）の両方が産卵期間を通して上昇したままでした。
野生で捕獲された雌と養殖された雌の間で平均濃度に差は見られなかった。ゴナドトロピン卵胞刺激ホルモン（FSH）と黄体形成ホルモン（LH）の血漿中濃度は、タイセイヨウオヒョウで初めて記録されました。
平均FSH濃度は、硝子体形成中に比較的安定していた。 10月から2月上旬まで 下垂体からのFSHの構成的放出と一致している。血漿FSHは産卵中に低レベルに減少しましたが、産卵が完了した後に再び増加しました。
血漿LH濃度は、生殖周期を通じて大きな個体差を示しました。 しかし、産卵中に高レベルが検出されました。これは、他の硬骨魚類で以前に報告された結果と一致していました。 多くのヒラメを含みます。
ゴナドトロピン放出ホルモンアゴニスト（GnRHa）の着床は、タイセイヨウオヒョウの雌では産卵時間を有意に早めませんでした。 しかし、個体間の産卵時間の明らかな同期が見られました、 処理された雌は、対照魚が使われる1か月前に産卵を完了した。商業生産では、 採卵におけるスタッフの努力は比較的短い期間に集中できるため、個人間の同期は利点となる可能性があります（図3を参照）。
タイセイヨウオヒョウのブリーダーは、排卵を監視し、定期的に剥ぎ取る必要があります。 卵子はinvitroで受精します。したがって、 GnRHa移植の使用は、種の商業的な種親管理にロジスティック上の利点を提供します。 産卵期を減らすことによって。
栄養
タイセイヨウオヒョウの幼虫の早期離乳のためのプロトコルの開発のために、 最初の給餌（dpff）から28日後の3つの異なる市販飼料での幼虫の飼料摂取量に関して大きな違いが見つかりました（図4を参照）。
市販の海洋幼虫の餌を与えられた幼虫乙姫（日本）は、5日間の餌を与えた後、完全な腸を持っていました。この食事は、15歳で離乳の最も早い時期を見つけることを目的とした実験で使用されました。 22および28dpff。 15 dpffで離乳すると、ほぼ100％の死亡率になりました。 22 dpffで約30％の死亡率、28dpffで ほぼゼロパーセントの死亡率。
結論は、タイセイヨウオヒョウの幼虫の飼料摂取量を確保するためには食餌特性が重要であり、幼虫は28dpffでのみ配合飼料を給餌する準備ができているということでした。初期の幼虫がこれらの食餌でうまく成長して成長するかどうかを評価するには、さらなる実験が必要です。
また、 成長したアルテミアの生産のためのプロトコルが開発され、栄養素組成が分析されました。アルテミアは培地ORI-culture（Skretting、 スペイン）そして中型のLARVIVA Multigain（Biomar、 デンマーク）は多くの面で改善された栄養素プロファイルを得ました。
タンパク質、 遊離アミノ酸とタウリンの含有量が増加し、 脂質とグリコーゲンが減少し、 一方、総脂質（TL）に対するリン脂質（PL）の比率は増加しました。ある実験で脂肪酸組成が改善し、 しかし、商業パートナーで実施されたものではありません。微量栄養素プロファイルは、ORI培地でのアルテミアの培養によって悪影響を受けませんでした。
以前の研究では、成長したアルテミアを与えられた幼虫がより良い品質の幼体に成長することがわかったので、 幼虫は、DIVERSIFYの従来のアルテミアノープリウスと比較して、成長したアルテミアを与えられました（図5を参照）。
成長に違いはありませんでした、 2つのグループ間の色素沈着または眼球移動と3週間の給餌後の幼虫の栄養組成は非常に類似していた。結論は、現代の方法で生産されたアルテミアノープリウスは、大西洋オヒョウの幼虫の要件をカバーするのに十分な栄養レベルを持っているということでした。
また、 再循環養殖システム（RAS）で飼育された幼虫は、腸内に別のミクロフローラを持っているという仮説と、 したがって、 栄養素の異なる取り込みが調べられました。しかし、 高レベルのビタミンK誘導体MK6を除いて、 RASで飼育された幼虫とフロースルーシステムの間で栄養利用に違いは見られませんでした。
ついに、 タイセイヨウオヒョウの幼魚（体重1グラム）には、TLの9〜32パーセントの範囲で5つのPLレベルの餌を与えました。腸の成長または脂質組成に対するPLレベルの影響はありませんでした。 肝臓と筋肉、 給餌後24時間。
しかし、 食事後の時間は腸組織の脂質組成に影響を及ぼしました、 食後1時間および4時間で中性脂質のレベルが高くなり、 および高レベルの極性脂質、 食後24時間のコレステロールエステルとセラミド、 食後早期の脂質の吸収を反映しています。
タイセイヨウオヒョウの幼魚は、さまざまなPL / Triacyl Glycerolを適用した場合、脂質種の組成を食事とは無関係に調節しているようです。 本研究のように（図6を参照）。
幼虫の飼育
アルテミアノープリウスの成長に関するプロトコルが開発され、説明されました。タイセイヨウオヒョウの幼虫の変態の臨界期における成長中のアルテミアの使用は、成長に関してアルテミアノープリウスの使用と異ならなかった。 死亡率と稚魚の品質。加えて、 成長したアルテミアの生産は労働集約的でした、 そして、商業的な幼生養殖におけるこの生きた飼料源の実施において、高い人件費は法外なものになるかもしれません。
大西洋オヒョウ稚魚の商業生産は現在、フロースルーシステム（FT）で行われています。 一方、RASは、幼虫のパフォーマンスの向上につながる、より安定した環境および化学的水パラメーターを提供するというコンセンサスが高まっています。
RASでの卵黄嚢と最初の摂食幼虫の生産プロトコルはDIVERSIFYで開発されました。卵黄嚢の孵卵中のRAS飼育とFT飼育の間で生存率の違いは検出されませんでした。システムが1か月間準備されたとき、 幼虫の成長は、最初の給餌中のRASグループで有意に高かった。 FTタンクの1つで高い死亡率が発生しました。
一緒に取られて、 結果は、RASの適切な調整により、 幼虫の成長と生存が次のように良好である安定したシステムが確立されます。 または最適な条件のFTシステムよりも優れています。 RASは、FTシステムと比較して、タイセイヨウオヒョウの幼虫にとってより安定した飼育システムでした。
飼育水と幼虫の細菌群集のメタゲノム特性は、少なくとも300〜400の異なる細菌属が飼育システムに存在することを明らかにしました。 RASシステムとFTシステムのマイクロバイオータ組成に有意差が検出されました：サイロとタンクの両方で、 そして水と幼虫の中で。
水中の微生物相と幼虫の微生物相との間に明らかな相関関係は見られなかった。マイクロバイオータ組成の特性評価は、大西洋オヒョウ幼虫のプロバイオティクス治療の開発のための重要な情報を提供します。
魚の健康
タイセイヨウオヒョウの幼虫に対するウイルス性神経壊死に対するワクチンを開発するために、 ノダウイルスのキャプシドタンパク質は、3つの異なるシステムで組換え発現に成功しました。大腸菌、 リーシュマニアtarentolaeとタバコ植物では、 予想通り、システム間で発現量にばらつきがありました。
加えて、 ピキアで発現した組換えキャプシドタンパク質は、EUプロジェクトTARGETFISHから提供されました。これらの4つの発現システムは、発現されたタンパク質が翻訳後グリコシル化される方法が異なります。緑色蛍光タンパク質（GFP）を発現する大腸菌とリーシュマニアタレントレアを構築して使用することにより、 アルテミアが効率的にろ過し、これらの微生物を摂取したことは、蛍光顕微鏡によって視覚化することができます。 そしてそれによって組換えタンパク質を宿している。
アルテミアは、さまざまなシステムによって発現される組換えノダウイルスキャプシドタンパク質を摂取しました。 これはイムノブロッティングで確認できます。
次に、異なるシステムによって発現された組換えキャプシドタンパク質をアルテミアに供給しました。 タイセイヨウオヒョウの幼虫に100dphで与えられました。 10週間後、 すべての治療グループの少年は、i.p。ノダウイルスを注射して（図7を参照）、有効性を確認します。
チャレンジされた魚はチャレンジの8週間後に終了し、ウイルスRNA2セグメントをターゲットとするリアルタイムRT-PCRによって脳内のノダウイルスの存在をテストしました。異なる治療グループ間で有意差は見られませんでした、 以前に保護を示した組換えタンパク質を持つグループを含みます。
これは、魚のサイズと、ワクチン接種時の異なる段階での個体間の大きな変動を最小限に抑えるために魚を分類する必要性には固有の制限があり、慎重に検討する必要があることを示しています。
結論は、 アルテミアはさまざまな形態の組換えノダウイルスキャプシドタンパク質を取り込み、蓄積し、タイセイヨウオヒョウの幼虫への経口送達のベクターとして機能することが示されていますが、 チャレンジ実験は、この抗原送達戦略がノダウイルス感染に対する防御を誘発しないことを示しています。 少なくともこの研究で使用された条件下で。
タイセイヨウオヒョウの技術生産マニュアルが作成されており、プロジェクトのWebサイト（www.diversifyfish.eu）からダウンロードできます。
この5年間のプロジェクト（2013〜 2018年）は、欧州連合の第7フレームワークプログラムから資金提供を受けています。 技術開発とデモンストレーション（KBBE-2013-07シングルステージ、 GA 603121、 多様化）。
コンソーシアムには、9つの中小企業を含む12のヨーロッパ諸国からの38のパートナーが含まれています。 2つの大企業、 5つの専門家協会と1つの消費者NGO-そしてHellenicCenter for MarineResearchによって調整されました。 ギリシャ。
