<図>
Bacillus pumilus 3-19のスブチリシン様プロテイナーゼ(AprBp)は、飼料添加物としての工業的使用の有望な候補です。しかし、 高収率の酵素を得るために、 効率の高い発現システムを開発する必要があります。
この研究の目的は、ピキアパストリス発現系におけるB. pumilus 3-19プロテアーゼ遺伝子の安定した発現を得て、酵素活性とベクタータイプおよびシグナルペプチドの選択との相関関係を評価することでした。この研究では、 メチロトローフ酵母細胞における最適化されたプロテアーゼ遺伝子の安定した発現のために、 ベクターpPINK-HCおよびpPINK-LCが選択されました。組換えプロテアーゼの細胞外分泌については、 効果的なシグナルペプチドのセットが使用されました。 α交配因子のプレシーケンスは、組換えタンパク質の分泌の増加を繰り返しもたらしました。一方で、 キラーおよびリゾチームシグナルペプチドの配列は、これまでP.pastorisでの細菌プロテアーゼの発現に使用されていませんでした。
pPINK-LCベクターに基づくコンストラクトを有する形質転換体のコロニーは、インキュベーションの3日目に検出され、pPINK-HCベクターに基づくコンストラクトを有するコロニーよりも高い形質転換効率を示した。 インキュベーションの7日目にのみ検出されました。 pPINK-LCベクターに基づく構造のインキュベーション10日目の形質転換効率は平均1.3×103形質転換体/μgDNA、 一方、1.03×103形質転換体/μgDNAは、pPINK-HCベクターを含むコンストラクトで記録されました。コロニーPCRは、選択されたすべての形質転換体コロニーが、酵母ゲノムに組み込まれたスブチリシン様プロテアーゼ遺伝子を含むことを示した。
この研究は、インキュベーション時間がP.pastorisのプロテアーゼ合成に影響を与えることを示しました。 酵素の最大活性が観察された。低コピーベクターpPINK-LCに基づくコンストラクトを含む酵母株は、アゾカゼインの加水分解においてより高いプロテアーゼ活性(U / ml)を示しました(キラーシグナルペプチド(SP)の場合は2.63±0.16、 α交配因子プレシーケンスの場合は2.49±0.08、 pPINK-HCベクター(キラーSPの場合は1.86±0.09、 α交配因子プレシーケンスの場合は2.21±0.07、 リゾチームSPの場合は1.31±0.11)、 どのシグナルペプチドが使用されたかに関係なく。最大のプロテアーゼ活性は、pPINK-LC-killer-aprBp(5.75±0.08U / ml)およびpPINK-LC-α-mat.factor-aprBp(4.33±0.07U / ml)コンストラクトを含む酵母株で得られました。
この研究は、組換えP.パストリス株からのスブチリシン様プロテアーゼがタンパク質分解活性を示すことを示した。 これは、インキュベーション時間とシグナルペプチドおよびベクターの選択に依存します。異種酵母ベースの発現システムによる細菌性プロテアーゼの生産は、このシステムを畜産用の新しい飼料添加物の開発に有望なものにします。
プロテアーゼは、工業用酵素の3つの最大のグループの中で評価されており、酵素の全世界販売の約60%を占めています。 その40%は細菌のプロテアーゼに属しています。細菌のセリンプロテアーゼは幅広い基質特異性を持っており、 さまざまな条件に対する高い耐性、 バイオテクノロジーでの使用を保証する、 特に農場の鳥や動物のためのバイオ添加剤として。さらに、 飼料にプロテアーゼを補給すると、動物によるアミノ酸の吸収が促進され、合成アミノ酸の購入資金が節約されます。飼料添加物としてプロテアーゼを使用すると、窒素の生物学的利用能が高まることも示されています。 これにより、土壌中のアンモニア汚染のレベルが低下します。また、 プロテアーゼは他の酵素の作用を促進し、飼料の費用対効果を高めます。 ブロイラーの腸内の有益な微生物叢の成長を促進するだけでなく。
今日、 ロシアでは、外国の製造業者からの限られた数の市販のプロテアーゼが使用されています。ロシア市場の主な代表者は、輸入飼料添加物CIBENZA DP100(NOVUS(88.1%)、 米国)、 RONOZYME®ProAct(DSM(9.4%)、 スイス)、 Axtra®PROTPT(DuPont(2.4%)、 ドイツ)。得られた組換え体は、スブチリシン様細菌プロテアーゼ(aprBp)遺伝子および3つの異なるシグナルペプチド(α-交配因子、 キラータンパク質とリゾチーム)。酵母培養液からのプロテアーゼのさらなる発現と精製、およびその生化学的および酵素的特性の研究は、組換え酵素の生物工学的展望を評価するのに役立ちます。
研究についてもっと読む、 PichiapastorisにおけるBacilluspumilus 3–19プロテアーゼの異種発現と養鶏における飼料添加物としてのその潜在的使用