Farshad Shishehchian著、 KritKhemayan、 Zahra Javidi、 ブルーアクアインターナショナルグループオブカンパニーズ、 タイ
エビ養殖は多くの病原性疾患の影響を劇的に受けています。 主に腸炎ビブリオと白斑症候群ウイルス（WSSV）によって引き起こされます。この研究の目的は、エッセンシャルオイル（ユーカリ、ユーカリ、 タイム、 それぞれフトモモ科とシソ科に属するオレガノ）、 病気に起因する病原体に対するエビの中鎖トリグリセリド（MCT）と天然の生物活性化合物、 特に腸炎ビブリオとWSSV。
結果は、AlphaGuard * LPlusがエビの病気の進行を効果的に遅らせることを示しました。これらの結果は、病原体に対するエビの防御を促進するために、AlphaGuard * PおよびAlphaGuard * LPLUSの機能性飼料添加物を使用できることを示唆しています。
序章
養殖強化の実践は、成長パフォーマンスに影響を与える健康と栄養によって妨げられています。これらの結果を解くために、 機能性飼料添加物は、エビの免疫を刺激し、エビのパフォーマンスを改善するために使用されています。特に、白斑を引き起こす急性肝膵臓壊死症（AHPND）や白斑症候群ウイルス（WSSV）を引き起こしたV.parahaemolyticusなどのエビ病を治療するためにウイルスや細菌の病原体を制御します。病気（WSD）、 バイオセキュリティ対策の実施と組み合わせる。
MCTとエッセンシャルオイルを構成するAlphaGuardの組成は、GRASプラクティスとして認識されています。この研究では、 AlphaGuard製品の効率は、ディスク拡散テスト結果からのデータの組み合わせによって得られました。 病気の課題と組織学、 エビの病気に対するAlphaGuard製品の効果の評価と一緒に。
材料および方法
病原菌とウイルス
エビの2つの病原性病原体、 グリセロールストック中の腸炎ビブリオと腸炎ビブリオ、 トリプシンソイブロス（TSB）+ 1％NaClで継代培養されています。 37oCで24時間インキュベートし、 チオ硫酸塩-クエン酸塩-胆汁塩-ショ糖寒天培地にストリークする前に、純粋な培養物を得ました。
WSSV懸濁液は、WSSVに感染したエビの筋肉から調製されました。簡単に言えば、 エビの筋肉に含まれるWSSVを-80°Cでの保管場所から取り出し、低温滅菌条件下で均一な断片に切断し、TNバッファー（20 mM Tris-HCl、 400 mMNaCl、 pH 7.4）0.1g / mlで。
2で遠心分離した後 4°Cで10分間000rpm、 上澄みを0.9％NaClで1：100に希釈し、0.45ミクロンでろ過しました。得られた上清を-80℃で保存した。 チャレンジ実験のWSSV注入源として使用されるまで。
抗菌作用
ディスク拡散試験
AlphaGuard * LPlusおよびAlphaGuard * Pの5µl、 0からの範囲の濃度、 0.25、 0.5、 NaCl 0.85パーセントで1.0および10パーセント希釈、 直径5ミリメートルに吸収され、 次に、厚さ0.9 mmの紙ディスクを風乾してから、幅100 x 15mmのペトリ皿内の105個の細菌培養細胞に入れます。 0.85パーセントのNaCl溶液をネガティブコントロールとして使用しました。各処理に3枚の複製プレートを使用し、24時間後に観察結果を記録しました。
V. parahaemolyticusによる人工感染と、エビ血リンパ（HL）および肝膵臓（HP）のビブリオ菌数の測定
V. parahaemolyticusは、-80°Cでの保存から再活性化され、TSB + 1％NaClで37°Cで一晩培養されました。培養物を5℃で遠心分離した。 000 rpmで10分間、 上澄みを取り除くために、 そしてペレットを滅菌0.85パーセントNaClに8.4×106CFU / mlの密度に再懸濁した。
海老、 5週目に、 培養5週目に健康なエビの第2腹部セグメントに100μLの細菌懸濁液を注入することにより感染し、死亡率を7日間記録した。
エビは、感染後3日目に各処理でランダムに収集され、滅菌水で3回洗浄されました。 HLは、滅菌条件下で1 mLの滅菌使い捨てシリンジを使用して心膜腔から抜き取り、等量の滅菌抗凝固剤に添加しました（450mMNaClに10mMEDTA-Na2を添加します。 10 mMKCl、 10 mM HEPES、 pH 7.3、 850mOsm.kg-1または10mM Tris-HCl、 250 mMスクロース、 100 mMクエン酸ナトリウム、 pH 7.6）。
HLと粉砕したHPを冷滅菌PBSで10倍に段階希釈しました。各希釈液を37℃のインキュベーターに逆さまに置いたTCBS寒天プレートに広げ、16〜20時間培養しました。 30〜300個の細菌コロニーを含むプレートを数えました。 次に、数値をCFU / mlまたはCFU / gとして記録しました。
WSSVによる人工感染
培養5週目に、ろ液mlを健康なエビに筋肉内注射しました。エビは、組織病理学的検査のために感染の6時間後にランダムに収集され、死亡率fが7日間記録されました。
エビの成長条件と実験群
エビは地元のタイの農場から購入しました。それらはVに対して陰性であるとテストされた。 PCR分析による腸炎ビブリオによるAHNPDおよびWSSV。水族館で1週間順応した後、 実験の前に、 体長が均一な明らかに健康なエビをランダムに3つのグループに分け、グループごとに6つの複製を作成しました。 複製ごとに20エビ。
水族館の容量は100リットルでした、 60リットルの海水が含まれています。塩水特性は15pptに維持されました。 pH7.7-8.0およびDO> 4.0mg / L。各処理には、各タンクにランダムにストックされた平均初期重量2.6gのエビの幼生が含まれています。
エビは体重の約2.5〜3パーセントまで満腹感を与えられました。 1日3回、5週間。給餌は毎日調整されました、 摂取率に応じて、 飼料が完全に消費されたことを確認します。給餌する前に、 脱皮、 糞便、 そして死んだエビは取り除かれました、 各タンクの水の20％は、3日ごとに新しい海水と交換されました。
実験食とデータ収集
すべてのグループが維持されました、 実験中、 順応と同じ条件下で。対照群には市販のエビペレットを与えました。 1パーセントのキチン-キトサンでコーティングされています。治療グループは、AlphaGuard * LPlusスプレーまたはAlphaGuard * Pによって供給されました。 市販のエビペレットと混合し、1パーセントのキチン-キトサンでコーティングし、 投与量5.0mlまたはg / Kg飼料で。死亡率と水質のパラメーターを毎日記録しました。裁判の終わりに、 生存率を評価した。
統計分析
統計分析実験ユニット、 戦車、 水族館は完全にランダム化された方法で配布されました。定量的データは、正規性と等分散性についてチェックされました。一元配置分散分析（ANOVA）を使用してデータを分析し、治療平均間の有意な（p <0.05）差異を検索しました。
結果
AlphaGuard * LPlusまたはAlphaGuard * Pの耐病性に対するディスク拡散法およびエビ食への含有による抗菌活性
ディスク拡散試験
AlphaGuard * LPlusとAlphaGuard * Pの濃度が少なくとも1％は、腸炎ビブリオと腸炎ビブリオの両方を阻害します。 しかし、 V.harveyiよりもV.parahaemolyticusの方が阻害効果が高かった。脂溶性物質で希釈した場合、AlphaGuardの有効濃度が低下した可能性があります。 エタノールなど、 検査用の。
エッセンシャルオイルの組成、 アッセイ技術と作用機序は集中的に見直されています。この研究では、そのメカニズムについて分子の詳細を調査していません。 しかし、 殺菌特性の主な効果は、エッセンシャルオイルとMCTからの親油性化合物としての膜の完全性と透過性の干渉に関連している可能性があります。
MCTの脂肪酸が異なれば、最小発育阻止濃度（MIC）も異なります。 脂肪酸の種類に応じて、 微生物、 および環境pH。 AlphaGuardの成分間の相乗的および拮抗的な側面は、この研究では解明されていません。 AlphaGuardのエッセンシャルオイルは、エビの抗ストレスに加えて、不飽和MCTの酸化を防止または遅らせて、その貯蔵寿命を延ばす抗酸化剤としても機能します。
腸炎ビブリオチャレンジテスト
飼料試験実験の終わりに、 エビは腸炎ビブリオに挑戦されました。累積死亡率がプロットされました（図2を参照）。死亡率の結果、 腸炎ビブリオを7日間チャレンジした後、 AlphaGuard * PおよびAlphaGuard * L Plusを給餌したエビのグループは、感染4日後の対照グループと比較して死亡率が有意に低いことを示しました。
AlphaGuard * PとAlphaGuard * L Plusはどちらも、感染5日後の統計的死亡率は同じでした。実験の終わりに、 対照的に、 生存率はAlphaGuard * Pの死亡率と統計的に相関していませんでした。 （図3を参照）。
ビブリオ属からのエビクリアランスの能力。感染の3日後にプロットされた後、 （図4を参照）。結果は、Vibriosppであることを示しました。 AlphaGuard * PおよびAlphaGuard * LPlusによって給餌されたエビの血リンパの数は、対照群よりも少なかった。 HPのバクテリアから防御するエビの能力、 AlphaGuard * LPlusによって供給され、 また、AlphaGuardを与えられていないエビよりもはるかに優れた防御能力を持っていました。
WSSVチャレンジテスト
WSSVチャレンジテストは、5週間の摂食試験の後に実施されました。累積死亡率がプロットされ、 （図5を参照）。 AlphaGuard * L Plusによって給餌されたエビのグループは、死亡率の大幅な遅延を示しました。 コントロールのグループとAlphaGuard * P-fedshrimpduringの2番目のグループと比較して、 3日目と4日目、 （図6を参照）。
これは、注射部位にHSSV感染組織を染色するH＆Eの組織病理学的兆候がないことと一致しています。 感染の3日後のエビの防御機構に関連している可能性が高い筋肉壊死の一般化を除いて。それにもかかわらず、 すべてのグループが100％の死亡率で終わった。
結論
この試験の結果は、AlphaGuard * PおよびAlphaGuard * L Plus飼料添加物を0.5％で市販飼料に適用すると、病原体に対するエビの防御を促進する効果が証明されたことを示唆しています。 AlphaGuard * L Pluseは、特に優れたパフォーマンスを示しました。
